生长因子体外诱导骨髓间充质干细胞向肝样细胞的分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2012.49.017

中国组织工程研究 ›› 2012, Vol. 16 ›› Issue (49): 9214-9220.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2012.49.017

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生长因子体外诱导骨髓间充质干细胞向肝样细胞的分化

陈鹏飞，魏文斌，谭远忠，胡晟

湖北省恩施州中心医院中医部消化内科，湖北省恩施市 445000

收稿日期:2012-09-04 修回日期:2012-09-11 出版日期:2012-12-02 发布日期:2012-09-11
通讯作者: 魏文斌，主任，主任医师，湖北省恩施州中心医院中医部消化内科，湖北省恩施市 445000 weiwenbin@ 163.com
作者简介:陈鹏飞★，男，1985年生，湖北省咸丰县人，土家族，2011年重庆医科大学毕业，硕士，医师，主要从事消化性疾病方面的研究。 xfcpff@163.com

In vitro differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells into hepatocyte-like cells induced by growth factor

Chen Peng-fei, Wei Wen-bin, Tan Yuan-zhong, Hu Cheng

Department of Gastroenterology, Traditional Chinese Medicine Part, Enshi Center Hospital, Enshi 445000, Hubei Province, China

Received:2012-09-04 Revised:2012-09-11 Online:2012-12-02 Published:2012-09-11
Contact: Wei Wen-bin, Chief physician, Department of Gastroenterology, Traditional Chinese Medicine Part, Enshi Center Hospital, Enshi 445000, Hubei Province, China weiwenbin@163.com
About author:Chen Peng-fei★, Master, Physician, Department of Gastroenterology, Traditional Chinese Medicine Part, Enshi Center Hospital, Enshi 445000, Hubei Province, China xfcpff@163.com

摘要/Abstract

摘要：

背景：肝细胞生长因子是体外诱导骨髓间充质干细胞向肝干细胞方向分化的关键性细胞因子。碱性成纤维细胞生长因子不仅能提高骨髓间充质干细胞的增殖速度及其寿命，且能在增殖过程中保留骨髓间充质干细胞的多向分化潜能。
目的：探讨肝细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子联合诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为肝样细胞的可行性。
方法：取大鼠股骨骨髓，用直接贴壁法分离纯化骨髓间充质干细胞并体外传代，流式细胞仪及成骨诱导对骨髓间充质干细胞进行鉴定。将细胞按以下分组进行成肝诱导：①M0组：不添加任何因子。②M1组：20 μg/L肝细胞生长因子。③M2组：20 μg/L肝细胞生长因子+5 μg/L碱性成纤维细胞生长因子。④M3组：20 μg/L 肝细胞生长因子+10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子。⑤M4组：20 μg/L肝细胞生长因子+20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子。倒置显微镜下观察细胞形态变化，在不同分化阶段用免疫细胞化学染色法检测不成熟肝细胞表型标志甲胎蛋白和成熟肝细胞表型标志细胞白蛋白的表达。
结果与结论：骨髓间充质干细胞诱导后呈肝样细胞形态改变。甲胎蛋白在诱导第7天细胞基本为阳性着色，在诱导第14天时表达降低，21 d表达为阴性。细胞白蛋白在诱导第14天细胞开始表达，而后持续。M0对照组未见阳性染色，同一时间点，M3、M4组细胞阳性染色率高于M2组(P < 0.05)。提示肝细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子具有体外诱导骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化的作用，二者有协同作用。

关键词: 肝细胞生长因子, 骨髓间充质干细胞, 分化, 碱性成纤维细胞生长因子, 肝样细胞

Abstract:

BACKGROUND: Hepatocyte growth factor is a key cytokine for in vitro inducing the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into liver stem cells. Basic fibroblast growth factor can not only increase the proliferation rate of mesenchymal stem cells and its life, but also can maintain the multilineage differentiation potential of mesenchymal stem cells in the proliferation process.
OBJECTIVE: To investigate the possibility of rat bone marrow mesenchymal stem cells to differentiate into hepatocyte-like cells induced by hepatocyte growth factor and basic fibroblast growth factor in vitro.
METHODS: Bone marrow mesenchymal stem cells were collected from femora of Sprague-Dawley rats. The harvested bone marrow mesenchymal stem cells were separated and purified by whole bone marrow adherent culture method, and passaged in vitro. The bone marrow mesenchymal stem cells were identified by flow cytometry and osteogenic induction. The cells were divided into groups: (1) M0 group: as a negative control, treated without any factor; (2) M1 group: as the positive control group, treated with 20 μg/L hepatocyte growth factor; (3) M2 group: treated with 20 μg/L hepatocyte growth factor+5 μg/L basic fibroblast growth factor; (4) M3 group: treated with 20 μg/L hepatocyte growth factor+10 μg/L basic fibroblast growth factor; (5) M4 group: treated with 20 μg/L hepatocyte growth factor+20 μg/L basic fibroblast growth factor. The morphological changes were observed under inverted microscope. At different stages of differentiation, the album expressions of of mature hepatocyte phenotype marker and alpha fetoprotein of immature hepatocyte phenotype marker were detected by immunohistochemical staining.
RESULTS AND CONCLUSION: The harvested bone marrow mesenchymal stem cells showed morphologic changes of hepatocyte after induction. The album was positively stained at 7 days after induction, its expression level was reduced at 14 days after induction, and then the expression changed into negative at 21 days after induction. The expression of alpha fetoprotein began to appear at 14 days after induction and then continued. No positive staining could be seen in the M0 group, and at the same time point, the positive staining rate in the M3 and M4 group was higher than that in the M2 group (P < 0.05). It indicates that hepatocyte growth factor and basic fibroblast growth factor can induce bone marrow mesenchymal stem cells to differentiate into hepatocyte-like cells, and there is synergistic effect between them.

中图分类号:

R394.2

陈鹏飞，魏文斌，谭远忠，胡晟. 生长因子体外诱导骨髓间充质干细胞向肝样细胞的分化[J]. 中国组织工程研究, 2012, 16(49): 9214-9220.

Chen Peng-fei, Wei Wen-bin, Tan Yuan-zhong, Hu Cheng. In vitro differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells into hepatocyte-like cells induced by growth factor[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2012, 16(49): 9214-9220.

图/表（结果） 9

2.1 骨髓间充质干细胞培养及表型特征鉴定结果实验采用全骨髓差异贴壁法获得的细胞开始呈现球形，24 h后开始贴壁生长，三四天后首次换液后将漂浮细胞除去，以后每隔3 d换液，接种6 d后见原代骨髓间充质干细胞呈集落样生长，集落逐渐增大，第8-12天集落相互接触，并铺满整个培养瓶底部，呈辐射状或漩涡状排列，见图1。

Figure 1 Morphology of rat bone marrow mesenchymal stem cells after primary cultured for 24 h (inverted microscope, ×100)

图1 大鼠骨髓间充质干细胞原代培养24 h形态(倒置显微镜, ×100)

取第3代的骨髓间充质干细胞，见图2，成骨诱导3周后，骨髓间充质干细胞可分化为成骨细胞，形成明显的圆形或卵圆形钙化结节，Von-Kossa法测矿化结节染色阳性，见图3。对照组细胞形态无明显变化，Von-Kossa法染色阴性，见图4。流式细胞仪检测培养的P3代骨髓间充质干细胞表面标记物CD29阳性率为97.81%、CD34 0.38%、CD45 0.49%、CD90 95.53%，见图5。

Figure 2 Morphology of passage 3 bone marrow mesenchymal stem cells (inverted microscope, ×100)
图2 第3代大鼠骨髓间充质干细胞形态(倒置显微镜，×100) 注：取第3代骨髓间充质干细胞行成骨诱导，形成明显的圆形或卵圆形钙化结节

Figure 3 Morphology of rat bone marrow mesenchymal stem cells after osteogenic induction (Von-Kossa staining, ×200)

图3 成骨诱导后大鼠骨髓间充质干细胞形态(Von-Kossa染色，×200) 注：未经诱导的细胞形态无明显变化

Figure 4 Morphology of rat bone marrow mesenchymal stem cells in the control group (inverted microscope, ×200)

图4 对照组大鼠骨髓间充质干细胞形态(倒置显微镜，×200)

Figure 5 Detection of passage 3 bone marrow mesenchymal stem cells phenotype by flow cytometry

图5 第3代骨髓间充质干细胞表面标记物流式细胞术检测结果

2.2 骨髓间充质干细胞诱导分化为肝样细胞的形态学改变骨髓间充质干细胞接种于培养板，各组加入诱导因子后，骨髓间充质干细胞分裂增殖逐渐停止，开始有少量细胞发生形态学的变化，在倒置显微镜下观察。诱导第7天，M₁_-₄各组细胞胞体逐渐回缩成圆形或多角形，见图6a，细胞贴壁能力减弱，扩增速度减慢，局部出现群聚；第14天诱导后表现为类圆形、圆形或多角形细胞增多，见图6b；21 d细胞形态表现为圆形为主，细胞呈肝细胞样圆形，见图6c。各不同浓度诱导组间的细胞形态学变化并无差别，阴性对照组细胞无明显形态学变化，仍呈纺锤形、螺旋状或漩涡状生长。

注：诱导第7天，各组细胞胞体逐渐回缩成圆形或多角形；第14天诱导后表现为类圆形、圆形或多角形细胞增多；21 d细胞呈肝细胞样圆形 Figure 6 Morphological changes of bone marrow mesenchymal stem cells after differentiating into hepatocyte-like cells (inverted microscope, ×200)

图6 骨髓间充质干细胞诱导分化为肝样细胞的形态学改变(倒置显微镜，×200)

2.3 骨髓间充质干细胞诱导分化为肝样细胞的免疫细胞化学染色结果甲胎蛋白作为不成熟肝细胞的表型标志，在诱导第7天出现细胞阳性表达，在诱导第14天时表达降低，21 d表达为阴性，见图7。

注：诱导第7天细胞出现甲胎蛋白阳性表达，在诱导第14天时表达降低，21 d表达为阴性 Figure 7 Expression of alpha fetoprotein in 20 μg/L hepatocyte growth factor+10 μg/L basic fibroblast growth factor group (×400)

图7 20 μg/L肝细胞生长因子+10 μg/L 碱性成纤维细胞生长因子组甲胎蛋白的表达(×400)

细胞白蛋白作为成熟肝细胞的表型标志，第14天开始出现表达，而后持续，见图8。

注：诱导第14天细胞开始出现细胞白蛋白阳性表达，而后持续 Figure 8 Expression of album in 20 μg/L hepatocyte growth factor+10 μg/L basic fibroblast growth factor group (×400)

图8 20 μg/L肝细胞生长因子+10 μg/L 碱性成纤维细胞生长因子组细胞白蛋白的表达 (×400)

显微镜下观察各组爬片上的细胞，以细胞浆中有棕黄色颗粒沉着为阳性表达，阴性对照组无阳性结果。随机选取5个非重复视野，计算阳性染色细胞的百分比。利用统计软件SPSS 13.0分析，如表1所示，同一时间点，M₁_-₄组间差异有显著性意义(P < 0.05)，其中M₁与M₂，M₃与M₄两两比较发现，其细胞阳性染色率差异均无显著性意义(P > 0.05)，M₃，M₄与M₂比较，差异有显著性意义(P < 0.05)。

表1 各组诱导7，14，21 d甲胎蛋白、细胞白蛋白染色阳性表达率比较

Table 1 Positive expression of album and alpha fetoprotein after induced for 7, 14 and 21 d in each group

(x(_)±s, n=5, %)

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引言

材料方法

设计：对比观察细胞学实验。

时间及地点：于2009年5月至2010年3月在重庆医科大学完成。

材料：健康4周龄SD大鼠，雌雄不拘，由重庆医科大学实验动物中心提供，许可证号: SCXK(渝)2007-0001。

方法：

骨髓间充质干细胞体外分离、培养^[8]：颈椎脱臼法处死大鼠，于骨髓中分离出细胞，置于 37 ℃、体积分数5% CO₂饱和湿度的培养箱中培养，三四天首次换液，以后每3 d换液1次。每天观察细胞生长情况，8-12 d细胞生长融合达80%以上，用含有0.01%EDTA的0.25%胰蛋白酶消化，按1∶2比例传代培养^[9-10]。

骨髓间充质干细胞的鉴定：收集培养的第3代骨髓间充质干细胞，PBS洗涤3次制备成单细胞悬液，每个样品约需2×10⁵个细胞；将重悬后的SD大鼠骨髓间质干细胞悬液转移至流式检测管中，分别加入CD29、CD34、CD45、CD90及同型对照各10 μL；避光室温孵育30 min；PBS冲洗2遍后进行流式检测；实验组加DMEM/ F12诱导液(完全培养基+10^-⁵ mmol/L地塞米松+0.3 mmol/L维生素C+10 mmol/L β-磷酸甘油钠)，对照组仅加入完全培养基，培养3周，PBS冲洗后40 g/L多聚甲醛固定细胞，Von-Kossa 法测矿化结节，显微镜下观察细胞外基质的钙沉积^[11]。

实验分组：体外诱导骨髓间充质干细胞分化为肝样细胞，取第3代的骨髓间充质干细胞，胰酶消化后，用含体积分数10%胎牛血清的

DMEM/F12调整细胞浓度为2×10⁴，分5组，分别接种于放有消毒盖玻片的6孔板内：①M₀组：不添加任何因子，设为阴性对照。②M₁组：20 μg/L肝细胞生长因子，阳性对照组。③M₂组：20 μg/L肝细胞生长因子+5 μg/L bFGF。④M₃组：20 μg/L肝细胞生长因子+10 μg/L bFGF。⑤M₄组：20 μg/L肝细胞生长因子+20 μg/L bFGF。

肝样细胞的鉴定：①形态学观察：倒置显微镜下观察细胞形态变化并拍照。②细胞免疫细胞化学染色：诱导培养7，14，21 d收集细胞制备爬片按照试剂盒说明书进行细胞免疫细胞化学染色，观察甲胎蛋白和细胞白蛋白的表达。400倍光镜下计数：随机选取5个非重复视野，计算阳性染色细胞的百分比。

统计学分析：由本文作者采用SPSS 13.0统计软件对实验数据进行统计学分析，各组资料均采用x(_)±s表示，采用单因素方差分析和q 检验，以P ≤ 0.05为差异有显著性意义。

讨论

骨髓干细胞主要有两大类，一类是造血干细胞，另一类则是骨髓间充质干细胞，前者对造血起着重要的支持作用。骨髓间充质干细胞来源于中胚层，是骨髓干细胞的重要组成部分[12-14]。自从Friedenstein等[15]首次成功地分离、培养出骨髓间充质干细胞并证实在一定条件下具有向成骨细胞和成软骨细胞分化的能力后，间充质干细胞的研究备受关注。目前分离获取骨髓间充质干细胞的方法主要有4种：全骨髓差异贴壁法[16]、免疫磁珠法、密度梯度离心法、流式细胞仪分离法[17]。本实验中选用全骨髓差异贴壁法获取骨髓间充质干细胞，操作简单，分离后的培养环境与原来的生长环境改变不大，保存了骨髓环境中丰富的黏附分子和各种生长因子的营养作用及其他细胞成分的支持作用，通过换液去除非贴壁的血细胞和造血细胞，提高了原代培养的成功率[18]。流式细胞结果示骨髓间充质干细胞高表达CD29、CD90，不表达或低表达造血系特异的CD34、CD45[19-20]，第3代骨髓间充质干细胞成骨诱导21 d后观察到钙结节，Von-Kossa法染色养阳性。表型标志和功能特性符合骨髓间充质干细胞的特点。
干细胞作为生物组织工程的种子细胞，诱导分化的特异性是生存微环境及自身特性联合作用的结果，其中干细胞生存微环境的作用最重要的[21]。诱导干细胞向其他组织细胞分化的方法主要有：培养液中加细胞生长因子；目的细胞的基因的转染；目的细胞共同培养。对于骨髓间充质干细胞向肝系细胞方向的诱导研究，多数是采用影响肝脏生长发育的细胞因子来模拟肝细胞的生长微环境进行诱导分化[22-23]。肝细胞生长因子是作用于肝脏发育及肝再生过程最基本的细胞因子。另有报道骨髓间充质干细胞可自行表达肝细胞生长因子及肝细胞生长因子受体/C-met，肝细胞生长因子与其受体相结合，启动一跨膜信号转导通路，通过Notch信号通路参与骨髓间充质干细胞分化为肝细胞过程，对肝脏发育、肝干细胞的生长、肝切除或化学损伤后的肝再生起重要作用[24]，因此认为肝细胞生长因子是体外诱导骨髓间充质干细胞向肝干细胞方向分化的关键性细胞因子[25]。黄盛东等[26]的研究显示，不同浓度肝细胞生长因子对细胞增殖活性的影响有明显差别，肝细胞生长因子浓度小至1 μg/L，对肝细胞就有促有丝分裂的作用，肝细胞生长因子促增殖作用的剂量范围是5-100 μg/L，此剂量范围之外肝细胞生长因子的促增殖作用不明显，其原因可能与结合位点饱和有关，结合位点饱和后，即使增加肝细胞生长因子的剂量或延长时间也不能提高骨髓间充质干细胞的增殖活性。在参阅大量文献及预实验的基础上作者将肝细胞生长因子浓度20 μg/L设为阳性对照组。bFGF是一种毛细血管增殖刺激剂，具有广泛的生物活性，可影响细胞的增殖和分化，不仅能提高骨髓间充质干细胞的增殖速度及其寿命，且能在增殖过程中保留骨髓间充质干细胞的多向分化潜能[27]。Saji等[28]把bFGF输入到小鼠体内能提高小鼠骨髓细胞向肝系细胞分化效率，并提高了其细胞白蛋白的分泌量，认为bFGF参与了肝脏早期发生过程。
实验联合应用20 μg/L 肝细胞生长因子和3种不同浓度的bFGF，对骨髓间充质干细胞进行诱导。为了进一步鉴定细胞，实验对细胞的特异标记物和功能进行了检测，免疫细胞化学检测甲胎蛋白、细胞白蛋白表达水平。肝细胞生长因子和bFGF两种刺激因子诱导后，相差显微镜下见骨髓间充质干细胞逐渐向椭圆形、圆形转化，伪足消失，细胞形态向肝细胞转化。甲胎蛋白和细胞白蛋白都是肝细胞的标记物，甲胎蛋白是肝前体细胞分泌的胞浆蛋白，在肝细胞分化早期出现，是肝细胞未成熟的标志，随着肝细胞发育成熟表达减少。随机选取5个非重复视野，计算阳性染色细胞的百分比，免疫细胞化学结果示，甲胎蛋白于7 d开始出现细胞阳性表达，14 d时表达降低，21 d不表达。细胞白蛋白是肝细胞分化成熟的标志，免疫细胞化学染色结果显示，细胞白蛋白于14 d开始出现细胞阳性表达，而后持续，其细胞阳性比率逐渐升高，表明向成熟肝细胞转化。而阴性对照组上述蛋白无表达。实验结果示，M1-4几种方案诱导后的细胞均能表达肝细胞表面标志，同一时间点，M1-4组间差异有显著性意义(P < 0.05)，其中M1与M2，M3与M4两两比较发现，差异均无显著性意义(P > 0.05)；M3、M4与M2比较，差异有显著性意义(P < 0.05)。联合应用肝细胞生长因子和bFGF诱导后的细胞肝细胞标志表达高，其中bFGF的适宜浓度为10 μg/L，bFGF浓度提高到20 μg/L并不能提高肝细胞表面标志的表达，低浓度的bFGF(5 μg/L)也不能发挥其联合诱导中的协同作用。
实验采用全骨髓差异贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞，研究表明骨髓间充质干细胞在肝细胞生长因子联和bFGF体外诱导下能够分化为肝样细胞，且较单用肝细胞生长因子高，这可能与bFGF刺激细胞增殖有关，也可能与bFGF能促进更多的骨髓间充质干细胞分化为肝样细胞，其具体机制值得深入探讨。进一步明确了骨髓间充质干细胞确实具有肝分化潜能，再一次证实了肝外干细胞的假说。本实验为下一步改变细胞的生长的微环境来诱导干细胞分化，促进骨髓间充质干细胞向肝细胞完全意义的转化提供了实验依据。

生长因子体外诱导骨髓间充质干细胞向肝样细胞的分化

In vitro differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells into hepatocyte-like cells induced by growth factor

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